3.3. Ejemplos de uso avanzado de Bioconductor

3.3.1. Implementación de tareas avanzadas con Bioconductor

Bioconductor es una herramienta poderosa para el análisis de datos genómicos y biológicos. Entre las tareas avanzadas que se pueden implementar se encuentran:

Anotación de secuencias: Utilizando paquetes como AnnotationDbi y org.Hs.eg.db, es posible anotar secuencias de ADN o ARN con información biológica relevante, como genes, transcripciones y funciones biológicas. Por ejemplo, se pueden mapear identificadores de genes (como ENSEMBL o Entrez) a nombres de genes y descripciones funcionales.

Análisis de datos de expresión génica: Con paquetes como limma y DESeq2, se pueden realizar análisis diferenciales de expresión génica a partir de datos de microarrays o RNA-seq. Esto incluye la normalización de datos, identificación de genes diferencialmente expresados y visualización de resultados mediante heatmaps o gráficos de dispersión.

3.3.2. Ejercicios prácticos

Ejercicio con BIOCONDUCTOR

A continuación, se desarrolla un ejercicio utilizando Bioconductor en R.

Este ejercicio cubre desde la carga de datos hasta el análisis de expresión génica diferencial, incluyendo la visualización de resultados. Utilizaremos datos de RNA-seq como ejemplo.

Ejercicio: Análisis de Expresión Diferencial con Bioconductor

Objetivo

Realizar un análisis de expresión diferencial (DEA) a partir de datos de RNA-seq para identificar genes que están regulados diferencialmente entre dos condiciones (por ejemplo, tratamiento vs control).

Pasos del Ejercicio

1. Instalación de paquetes necesarios.
2. Carga de datos de expresión génica.
3. Preprocesamiento y normalización de datos.
4. Análisis de expresión diferencial.
5. Visualización de resultados.
6. Interpretación y generación de reportes.

A continuación, se desarrolla un ejercicio utilizando Bioconductor en R.

1. Instalación de paquetes necesarios (En caso de requerirse)

Primero, instalamos los paquetes de Bioconductor necesarios para este análisis:

Ejecutar desde la consola de R:

Código

############
if (!require("BiocManager", quietly = TRUE))
    install.packages("BiocManager")

BiocManager::install(c("DESeq2", "airway", "pheatmap", "ggplot2", "AnnotationDbi", "org.Hs.eg.db"))
############

2. Carga de datos de expresión génica

Utilizaremos el paquete airway, que contiene un conjunto de datos de RNA-seq de un experimento con células de las vías respiratorias humanas tratadas con dexametasona.

La librería airway es un paquete de datos en Bioconductor que proporciona un conjunto de datos de RNA-seq (secuenciación de ARN) preprocesado y listo para usar. Estos datos provienen de un estudio científico real y se utilizan comúnmente como un ejemplo estándar en tutoriales y análisis de bioinformática, especialmente para demostrar el uso de herramientas como DESeq2 para el análisis de expresión diferencial.

• Origen de los datos: Los datos en airway provienen de un estudio publicado en 2013 por Himes et al. en la revista PLoS ONE. El estudio analizó el efecto de la dexametasona (un glucocorticoide sintético) en células de las vías respiratorias humanas (airway smooth muscle cells).
• Tipo de datos: Contiene datos de RNA-seq, que incluyen conteos de lecturas (reads) mapeados a genes para varias muestras.
• Formato: Los datos están almacenados en un objeto de tipo SummarizedExperiment, que es una estructura de datos común en Bioconductor para almacenar y manipular datos genómicos.

El objeto airway incluye:

1. Conteos de lecturas (counts):
• Matriz de conteos de lecturas mapeadas a genes para cada muestra.
• Las filas representan genes (identificados por ENSEMBL IDs).
• Las columnas representan muestras (4 tratadas con dexametasona y 4 no tratadas).
2. Metadatos de las muestras (colData):
• Información sobre las muestras, como:
• SampleName: Identificador de la muestra.
• cell: Línea celular.
• dex: Condición de tratamiento (tratado con dexametasona o no tratado).
• albut: Indicador de uso de albuterol (un broncodilatador).
• Run: Identificador de la corrida de secuenciación.
3. Metadatos de los genes (rowData):
• Información sobre los genes, como sus identificadores (ENSEMBL IDs).

El objeto airway es un SummarizedExperiment, que tiene la siguiente estructura:

• assays: Contiene la matriz de conteos de lecturas.

Una matriz de conteos de lecturas mapeadas a genes (filas: genes, columnas: muestras).

• colData: Contiene los metadatos de las muestras.

Información sobre las muestras, como la condición de tratamiento (dex: dexametasona) y la línea celular.

• rowData: Contiene los metadatos de los genes

Identificadores de genes (ENSEMBL IDs).

• metadata: Información adicional sobre el experimento.

El conjunto de datos airway se utiliza principalmente para demostrar el flujo de trabajo de análisis de RNA-seq

1. 1. Carga de datos

Código

############
library(DESeq2)
library(airway)
# Cargar el conjunto de datos
data("airway")
se <- airway
############

Exploración de los datos:

Código

############
# Ver el objeto
airway
############
# Ver los conteos de lecturas
head(assay(airway))
tail(assay(airway))
############
# Ver metadatos de las muestras
colData(airway)
############
# Ver metadatos de los genes
rowData(airway)

Análisis de expresión diferencial:

El paquete airway se usa comúnmente con DESeq2 para realizar análisis de expresión diferencial entre las muestras tratadas y no tratadas con dexametasona.

2. Conversión a objeto DESeqDataSet

El objetivo es convertir el objeto airway en un DESeqDataSet, que es el formato requerido por el paquete DESeq2 para realizar el análisis de expresión diferencial.

Diseño experimental: El argumento “design = ~dex” especifica que queremos comparar las muestras en función de la condición de tratamiento (dex: dexametasona).

El objeto dds contendrá:

• Los conteos de lecturas.
• Los metadatos de las muestras.
• El diseño experimental para el análisis.

Código

########
library(DESeq2)
# Convertir a objeto DESeqDataSet
dds <- DESeqDataSet(airway, design = ~ dex)

3. Filtrado de genes con baja expresión

Tiene por objeto eliminar genes con baja expresión, ya que no proporcionan información útil para el análisis.

• Como criterio de filtrado se conservan los genes que tienen al menos 10 lecturas en total en todas las muestras combinadas.
• El objeto dds ahora contiene solo los genes que cumplen con el criterio de expresión mínima.
• Esto reduce el número de genes y mejora la precisión del análisis.

Código

########
# Filtrar genes con baja expresión
keep <- rowSums(counts(dds)) >= 10
dds <- dds[keep, ]
########

4. Normalización y análisis de expresión diferencial

En este paso se busca normalizar los datos y realizar el análisis de expresión diferencial.

Pasos que realiza DESeq:

1. Estimación de factores de tamaño: Ajusta las diferencias en la profundidad de secuenciación entre muestras.
2. Dispersión de genes: Estima la variabilidad biológica entre muestras.
3. Ajuste del modelo: Compara las condiciones de tratamiento para identificar genes diferencialmente expresados.

El objeto dds ahora contendrá los resultados del modelo estadístico.

Código

########
# Normalización y análisis
dds <- DESeq(dds)
########

5. Extracción de resultados

En este punto se extraen los resultados del análisis de expresión diferencial.

Contraste: Especificamos que queremos comparar las muestras tratadas con dexametasona (trt) frente a las no tratadas (untrt).

El objeto res contiene:

• log2FoldChange: Cambio en la expresión (en escala logarítmica) entre las condiciones.
• pvalue: Valor p sin ajustar.
• padj: Valor p ajustado (corregido por múltiples pruebas).
• baseMean: Expresión media normalizada del gen.

Aquí se puede interpretar que:

• log2FoldChange > 0: El gen está sobreexpresado en la condición tratada.
• log2FoldChange < 0: El gen está subexpresado en la condición tratada.
• padj < 0.05: El gen se considera significativamente diferencialmente expresado.

Código

########
res <- results(dds, contrast = c("dex", "trt", "untrt"))
########

6. Visualización de resultados

Se pueden generar gráficos como heatmaps, MA plots y PCA para visualizar los resultados.

Código

########
# MA plot
plotMA(res)

# Heatmap de los genes más significativos
library(pheatmap)
top_genes <- head(order(res$padj), 20)
pheatmap(assay(dds)[top_genes, ], scale = "row")
########

Como resultado se obtienen los gráficos:

1. MA plot (Mean of Normalized Counts vs Log Fold Change), y;
2. Heatmap con dendrograma (muestras SRRXXXXXXX vs genes ENSG00000XXXXXX).

Ambos son herramientas visuales comunes en el análisis de expresión diferencial y proporcionan información complementaria sobre los resultados.

Gráfico MA Plot (Mean of Normalized Counts vs Log Fold Change)

Este gráfico muestra en el eje X (Mean of Normalized Counts) la expresión media normalizada de un gen en todas las muestras (en escala logarítmica), mientras que en el eje Y (Log Fold Change) el cambio en la expresión de un gen entre dos condiciones (en escala logarítmica base 2).

Puntos: Cada punto representa un gen.

Línea horizontal en Y=0: Indica que no hay cambio en la expresión entre las condiciones.

Interpretación:

1. Puntos cerca de Y=0:
• Genes con poco o ningún cambio en la expresión entre las condiciones.
• Estos genes no son de interés en el análisis de expresión diferencial.
2. Puntos por encima de Y=0:
• Genes con log2FoldChange > 0 (sobreexpresados en la condición tratada).
• Cuanto más alejados estén de Y=0, mayor es el cambio en la expresión.
3. Puntos por debajo de Y=0:
• Genes con log2FoldChange < 0 (subexpresados en la condición tratada).
• Cuanto más alejados estén de Y=0, mayor es el cambio en la expresión.
4. Puntos coloreados (generalmente rojos):
• Representan genes significativamente diferencialmente expresados (con un padj < 0.05).
• Estos genes son los más relevantes para el análisis.
5. Distribución de puntos:
• Si la mayoría de los puntos están cerca de Y=0, significa que la mayoría de los genes no cambian significativamente entre las condiciones.
• Si hay muchos puntos alejados de Y=0 (especialmente los coloreados), indica que hay muchos genes diferencialmente expresados.

Si un gen tiene un log2FoldChange = 2 y está coloreado en rojo, significa que está significativamente sobreexpresado en la condición tratada (4 veces más expresado).

Si un gen tiene un log2FoldChange = -1.5 y está coloreado en rojo, significa que está significativamente subexpresado en la condición tratada (aproximadamente 2.83 veces menos expresado).

Gráfico Heatmap con Dendrograma (Muestras SRRXXXXXXX vs Genes ENSG00000XXXXXX)

Este gráfico de mapa de calor (heatmap) con dendrograma es una representación gráfica en la que los valores de expresión de los genes se representan con colores (rojo para sobreexpresión y azul para subexpresión).

El eje Y (filas) muestra los genes (identificados por ENSEMBL IDs, como ENSG00000XXXXXX), mientras que el eje X (columnas) presenta las muestras (identificadas por códigos como SRRXXXXXXX).

El dendrograma es un árbol jerárquico que agrupa muestras o genes basándose en su similitud en los patrones de expresión.

1. Colores en el heatmap:
• Rojo: Indica sobreexpresión del gen en esa muestra.
• Azul: Indica subexpresión del gen en esa muestra.
• Blanco o tonos claros: Indica expresión media o sin cambios.
2. Agrupación de muestras (dendrograma superior):
• Muestras que se agrupan juntas tienen patrones de expresión similares.
• Si las muestras de la misma condición (por ejemplo, tratadas vs no tratadas) se agrupan juntas, sugiere que el tratamiento tiene un efecto claro en la expresión génica.
3. Agrupación de genes (dendrograma lateral):
• Genes que se agrupan juntos tienen patrones de expresión similares en todas las muestras.
• Esto puede indicar que los genes están co-regulados o tienen funciones biológicas relacionadas.
4. Genes diferencialmente expresados:
• Los genes más relevantes son aquellos que muestran un patrón claro de sobreexpresión o subexpresión en las muestras de una condición específica.

Si las muestras SRRXXXXXXX de la condición tratada se agrupan juntas y muestran un patrón de sobreexpresión (rojo) para un conjunto de genes, esto sugiere que esos genes están regulados positivamente por el tratamiento.

Si un grupo de genes ENSG00000XXXXXX se agrupa y muestra subexpresión (azul) en las muestras tratadas, esto sugiere que esos genes están regulados negativamente por el tratamiento.

3.3.3. Aplicación de funciones estadísticas y generación de reportes

Bioconductor permite aplicar funciones estadísticas avanzadas para el análisis de datos biológicos. Por ejemplo, se pueden realizar análisis de enriquecimiento funcional con el paquete clusterProfiler para identificar rutas biológicas significativas. Además, se pueden generar reportes automatizados utilizando knitr y rmarkdown, integrando código, resultados y visualizaciones en un documento final.

En el ejercicio previo y el cuaderno de trabajo 11 se muestran ejemplos de reportes y visualizaciones.

3.4. Ejemplos de uso avanzado de BioPython

3.4.1. Implementación de análisis avanzados con BioPython

BioPython es una biblioteca de Python ampliamente utilizada en bioinformática. Entre sus funcionalidades avanzadas se encuentran:

• Alineamiento de secuencias: Utilizando el módulo Bio.Align, se pueden realizar alineamientos locales y globales de secuencias con algoritmos como Needleman-Wunsch y Smith-Waterman. También se pueden realizar alineamientos múltiples con herramientas como ClustalW o MUSCLE.
• Búsqueda de motivos en secuencias: Con el módulo Bio.motifs, se pueden buscar motivos específicos en secuencias de ADN o ARN, lo que es útil para identificar sitios de unión de factores de transcripción o secuencias reguladoras.

En la clase 7 se ha desarrollado el cuaderno 10, donde se desarrollaron ejercicios con Biopython.

3.4.2. Ejercicios prácticos

Resolución de dependencias

Resolver dependencias es un paso crucial para garantizar que los proyectos en R y Python funcionen correctamente. Estas dependencias pueden incluir tanto librerías del sistema operativo (por ejemplo, en Debian) como paquetes o módulos de R y Python. A continuación, se describe el proceso para resolver estas dependencias en ambos lenguajes.

Ejecute el cuaderno:

• Cuaderno12_Librerias_Python_adicionales_Apellido_Nombre.ipynb

Para comenzar actualizaremos el sistema operativo Debian®:

sudo apt update
sudo apt upgrade

Al finalizar le preguntará dónde escribir el GRUB; seleccione /dev/sda

Reinicie la máquina para verificar que todo ha ido bien:

sudo reboot

PIP

Pip es el gestor de paquetes estándar para Python, utilizado para instalar, actualizar y gestionar bibliotecas y dependencias de software escritas en este lenguaje. Paera actualizar este gestor ejecute:

pip install --upgrade pip

Es posible que se le muestre la advertencia “DEPRECATION: Loading egg at /home/jupyter/jupyter/lib/python3.11/site-packages/SeqUtils-1.0.11-py3.11.egg is deprecated. pip 25.1 will enforce this behaviour change. A possible replacement is to use pip for package installation. Discussion can be found at https://github.com/pypa/pip/issues/12330”

Esto muestra que la librería SeqUtils quedará obsoleta en futuras versiones de este ecosistema. Si no quiere recibir esta advertencia cada vez que use pip, puede desinstalarla con:

pip uninstall SeqUtils -y
#Librería pandas para el manejo de dataframes
pip install pandas
#Librerías para graficación:

pip install matplotlib
pip install seaborn
pip install graphviz
pip install pydot

#Librería para análisis estadístico

pip install statsmodels
pip install pingouin

#Librería para interactuar con las rutas de los sistemas operativos

pip install pathlib

#Librerías para biología computacional

pip install biopython

#Librerías para aprendizaje automático

pip install scikit-learn
pip install mlxtend

#openpyxl para leer y escribir archivos Excel (R) 2010

pip install openpyxl
pip install xlrd

#Herramienta para el procesamiento de lenguaje natural

pip install nltk

#Herramienta para asociación (Aprendizaje no supervisado)

pip install apyori

#Herramienta para Big Data con Spark

pip install pyspark

#Exportar los cuadernos a PDF vía LaTEX

#Abra un terminal y ejecute las siguientes instrucciones:

sudo apt-get install texlive-xetex
sudo apt-get install texlive-fonts-recommended

Instalación de librerías adicionales en R

Las siquientes librerías implementan herramientas para la capa de visualización en R por lo que de acuerdo a su necesidad se recomienda su instalación.

Este cuaderno tiene como objetivo:

1. Instalar librerías adicionales en R
2. Instalar paquetes en R desde repositorios específicos
3. Instalar paquetes en R desde fuentes exrernas como github
4. Resolver problemas de dependencias con librerías o paquetes de sistema operativo (Debian®)